等電點(diǎn)(PI)/電荷工程  

通常，mAb可以通過(guò)非特異性內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移到內(nèi)體。非特異性內(nèi)吞作用的機(jī)制不依賴于靶抗原，因此，雖然這種機(jī)制有助于清除所有單抗，但其對(duì)清除的貢獻(xiàn)率因單抗不同而不同。據(jù)報(bào)道，通過(guò)內(nèi)吞作用攝取大分子的速率受到電荷/PI的影響。研究顯示陽(yáng)離子分子(高等電點(diǎn)/正電荷)通過(guò)內(nèi)吞作用表現(xiàn)出比陰離子分子(低等電點(diǎn)/負(fù)電荷)更高的攝取速率。給野生型小鼠靜脈注射8株不同等電點(diǎn)的人源化IgG4單抗后進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究，結(jié)果顯示等電點(diǎn)與清除率呈顯著正相關(guān)，與半衰期呈顯著負(fù)相關(guān)（圖1）。此外，在FcRn功能缺陷的B2M基因敲除小鼠中，用4株具有代表性的單抗也證實(shí)了PI與清除率或半衰期的相關(guān)性以及PI效應(yīng)與FcRn無(wú)關(guān)。

圖1. 在普通鼠中不同等電點(diǎn)的人源化IgG4單抗的藥代動(dòng)力學(xué)

組織分布研究評(píng)估了不同等電點(diǎn)的mAb的清除途徑，發(fā)現(xiàn)PI較高的mAb在肝和脾這兩個(gè)高度血管化的器官中的降解率很高。

因此通過(guò)抗體優(yōu)化過(guò)程中，降低pI/電荷將是改善mAb藥代動(dòng)力學(xué)的一個(gè)有價(jià)值的途徑。例如通過(guò)在可變區(qū)和恒定區(qū)引入突變，可以降低mAb的等電點(diǎn)/電荷。目前已經(jīng)報(bào)道通過(guò)降低等電點(diǎn)或平衡電荷分布可以改善mAb對(duì)IL-12/23、 HER2、LTA等靶點(diǎn)的藥代動(dòng)力學(xué)。這里不再詳細(xì)表述。然而改變可變區(qū)的氨基酸可能會(huì)影響其抗原結(jié)合親和力或生物物理性質(zhì)，而將恒定區(qū)的氨基酸改變?yōu)榉亲匀恍蛄锌赡軙?huì)增加免疫原性的風(fēng)險(xiǎn)。因此，在應(yīng)用PI/電荷工程改善mAb的藥代動(dòng)力學(xué)時(shí)應(yīng)考慮這些因素。

  增強(qiáng)與FcRn的結(jié)合的抗體工程技術(shù)  

新生兒Fc受體（FcRn）是一種MH1Like異二聚體，在細(xì)胞運(yùn)輸和IgG的血清半衰期中發(fā)揮核心作用。mAb通?？梢酝ㄟ^(guò)FcRn循環(huán)系統(tǒng)從內(nèi)體循環(huán)回血漿，使mAb在體內(nèi)表現(xiàn)出較長(zhǎng)的半衰期和較低的清除率。雖然FcRn可以將mAb從內(nèi)體循環(huán)到血漿中，但在酸性pH條件下，通過(guò)抗體工程來(lái)增加FcRn的結(jié)合，進(jìn)一步提高mAb的回收效率。

在過(guò)去的十幾年中，已經(jīng)報(bào)道了一些突變來(lái)增強(qiáng)了FcRn在酸性pH條件下的結(jié)合，并提高了從內(nèi)體到血漿的回收效率（圖2）。

圖2. Fc 工程增強(qiáng)抗體與FcRn結(jié)合

噬菌體展示Fc變體文庫(kù)的篩選鑒定了在pH 6.0下具有增強(qiáng)與人FcRn結(jié)合的突變體YTE（M252Y / S254T / T256E）。研究顯示，YTE變體與人和食蟹猴FcRn的結(jié)合能力增加了10倍，在食蟹猴PK研究中半衰期增加了4倍。Motavizumab-YTE是一種靶向呼吸道合胞病毒的人源化抗體，是第一種針對(duì)FcRn介導(dǎo)的半衰期延長(zhǎng)而設(shè)計(jì)的抗體，已在人類受試者中進(jìn)行測(cè)試。I期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，相對(duì)于Motavizumab IgG1，其半衰期增加2至4倍。而且Motavizumab-YTE和Motavizumab的抗藥抗體(ADA)發(fā)生率相當(dāng)，提示YTE突變不會(huì)增加人類免疫原性的風(fēng)險(xiǎn)。YTE突變的應(yīng)用對(duì)生物利用度也沒(méi)有負(fù)面影響。YTE突變的缺點(diǎn)之一可能是FcγRIIIA結(jié)合減少，導(dǎo)致ADCC活性降低。當(dāng)ADCC被要求作為一種作用模式時(shí)，使用YTE突變應(yīng)該慎重考慮。此外，−8?C發(fā)現(xiàn)，具有YTE突變的IgG與WT hIgG1相比具有較低的熱穩(wěn)定性，這可能會(huì)影響抗體的溶解性和聚集性。

Zalesky等人研究表明M428L/N434S突變(LS)在pH6.0下對(duì)人FcRn的親和力增加11倍。當(dāng)用含有LS突變的抗VEGF抗體處理人FcRn轉(zhuǎn)基因荷瘤小鼠時(shí), 與IgG1處理的動(dòng)物相比，觀察到更好的抗腫瘤效果。這是FcRn依賴性半衰期增加導(dǎo)致改善的抗腫瘤活性的第一個(gè)體內(nèi)證明。與YTE突變不同，LS突變保留了與WT IgG1抗體相當(dāng)?shù)腇cγRIIIA結(jié)合和ADCC活性。因此，當(dāng)療效需要ADCC活性時(shí)，LS突變比YTE突變更合適。首次用ALXN1210(Raverizumab)研究LS突變對(duì)單抗藥代動(dòng)力學(xué)的影響。ALXN1210是一種人源化的具有LS突變的抗補(bǔ)體C5IgG2/4單抗，用于陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿和非典型溶血性尿毒癥綜合征。其是eculizumab工程化版本，通過(guò)基因工程改造Fc區(qū)域，引入的氨基酸替代(VH_Y27H，VH_S57H，M428L，N434S)導(dǎo)致半衰期延長(zhǎng)4倍，允許劑量從每2周減少到每8周一次，同時(shí)保持療效。ALXN1210是目前唯一一個(gè)通過(guò)增加與FcRn的結(jié)合改善半衰期而獲得FDA批準(zhǔn)的治療性抗體。

另一個(gè)提高抗體半衰期的機(jī)制是通過(guò)Fc工程設(shè)計(jì)抗體變體，在胞外pH條件下與FcRn不結(jié)合，在胞內(nèi)pH增強(qiáng)FcRn的結(jié)合。pH為7.4時(shí)IgG的殘留結(jié)合已被證明對(duì)血漿循環(huán)和循環(huán)持久性有負(fù)面影響。這一過(guò)程對(duì)于需要釋放到血漿中并在那里持續(xù)存在的抗體是有利的，例如，針對(duì)細(xì)胞結(jié)合靶標(biāo)的抗體。Lee等人合理設(shè)計(jì)大腸桿菌高通量篩選文庫(kù)，以鑒定在pH 5.8而不在pH 7.4時(shí)選擇性與FcRn結(jié)合的hIgG1 Fc突變。通過(guò)這些篩選策略，他們發(fā)現(xiàn)突變體L309D/Q311H/N434S（DHS）在胞內(nèi)pH與FcRn結(jié)合的能力是WT hIgG1的5倍，而在細(xì)胞外pH下不結(jié)合。在體內(nèi)， hIgG1-DHS在hFcRn/hβ2M/hFCγR的小鼠中的半衰期是WT hIgG1的4倍以上。與YTE突變不同，DHS突變的抗體同樣保持了FcγR結(jié)合的能力以及ADCC活性。

另外也可以設(shè)計(jì)突變來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞外pH的結(jié)合。識(shí)別在細(xì)胞外pH下與FcRn有不同結(jié)合的抗體變體的一個(gè)基本理念是產(chǎn)生所謂的“sweeping 抗體”來(lái)清除可溶性靶標(biāo)。因?yàn)槭褂贸Ｒ?guī)抗體靶向可溶性抗原的一個(gè)不良后果是，它可能會(huì)導(dǎo)致抗原量增加。這是由于IgG的半衰期比結(jié)合的抗原的半衰期要長(zhǎng)得多，從而使得抗體-抗原復(fù)合物的積累，由于清除率的減少而增加了血漿抗原的存在。為了改善這一點(diǎn)，通過(guò)設(shè)計(jì)sweeping 抗體，以增強(qiáng)與FcRn在胞內(nèi)和胞外pH的結(jié)合。在pH 7.4時(shí)，增加與FcRn的結(jié)合可以阻止抗體釋放到血漿中，使其與可溶性抗原形成復(fù)合物，抗體-抗原復(fù)合物然后可以迅速內(nèi)化到細(xì)胞內(nèi)。sweeping 抗體通常被設(shè)計(jì)成一旦內(nèi)化在內(nèi)體中就能與抗原解離，從而溶酶體只針對(duì)性的降解抗原（圖3）。

圖3.sweeping 抗體作用機(jī)制示意圖

研究發(fā)現(xiàn)突變體M252Y/S254T/T256E+H433K/N434F(簡(jiǎn)稱YTE-KF)與FcRn的結(jié)合在胞內(nèi)和胞外pH時(shí)均增加了20倍。另一個(gè)能增強(qiáng)與FcRn結(jié)合的hIgG1突變的例子是M252Y/V308P/N343Y突變。與WT-hIgG1相比，在胞外pH條件下與FcRn的結(jié)合>2500倍，在內(nèi)體與FcRn的結(jié)合增加了>400倍。在體內(nèi)，與WT hIgG1抗體相比，攜帶M252Y/V308P/N343Y突變的IL-6R抗體在處理hFcRn轉(zhuǎn)基因小鼠后，血漿中的人可溶性IL-6R總量降低了1000倍。

如上所述，改善半衰期的FC工程將賦予mAb更長(zhǎng)的生物利用度和潛在的治療效果，同時(shí)降低了給藥頻率。

  pH依賴性解離靶抗原的抗體工程技術(shù)  

據(jù)報(bào)道，一些單抗在動(dòng)物和人身上都表現(xiàn)出TMDD。TMDD常見(jiàn)于靶抗原位于細(xì)胞表面(膜結(jié)合的靶抗原)，如IL-6受體、EGFR、CD40、CD81、OX40(CD134)等。TMDD消除快，半衰期短，導(dǎo)致血漿/血清抗體濃度低。因此，當(dāng)TMDD發(fā)生時(shí)，需要更頻繁或更高的劑量來(lái)維持血漿/血清中抗體的有效濃度。

為了克服在靶向膜結(jié)合的靶抗原時(shí)這種快速消除的問(wèn)題，發(fā)明了能夠依賴pH與靶抗原結(jié)合的mAb。在這個(gè)概念中，mAb首先與膜結(jié)合的靶抗原結(jié)合，然后與靶抗原一起內(nèi)化到內(nèi)體中。然后，在酸性內(nèi)體(pH 6.0左右)中，mAb與靶抗原解離。雖然靶抗原隨后會(huì)被轉(zhuǎn)移到溶酶體并降解，但解離的mAb與酸性內(nèi)體中的FcRn結(jié)合，并被循環(huán)回到質(zhì)膜，從FcRn釋放到血漿中。這種方法已經(jīng)被證明是有效的，可以最大限度地減少TMDD介導(dǎo)的快速消除。

例如通過(guò)在常規(guī)人源化IL-6受體IgG1抗體中引入幾個(gè)組氨酸突變和其他一些突變，產(chǎn)生了一種新型的具有pH依賴性結(jié)合特性的人源化IL-6受體IgG1抗體(稱為循環(huán)抗體)。酸性條件下的組氨酸質(zhì)子化改變了mAb的結(jié)構(gòu)，改變了mAb與靶抗原的靜電相互作用。人源化的無(wú)pH依賴性結(jié)合的IL-6受體IgG1抗體tocilizumab，在pH 7.4和6.0, 其KD與人可溶性IL-6R僅相差2倍，而pH依賴性結(jié)合的變異體(PH2)的KD則相差22倍。在食蟹猴中，與tocilizumab、tocilizumab-FcRn(tocilizumab帶有N434A突變的tocilizumab)和親和力成熟的tocilizumab-FcRn(與N434A突變的tocilizumab高親和力tocilizumab-FcRn)相比，PH2-FcRn(PH2在Fc中有N434A突變，以增加FcRn在酸性pH下的結(jié)合并改善清除率)顯著改善了靜脈和皮下注射后的清除率。盡管單獨(dú)增加FcRn結(jié)合并沒(méi)有改善藥代動(dòng)力學(xué)，但pH依賴結(jié)合和增加FcRn結(jié)合的組合確實(shí)顯著改善了tocilizumab的藥代動(dòng)力學(xué)(圖4)。比較Tocilizumab和PH2-FcRn的IL-6受體中和時(shí)間，PH2-FcRn 2 mg/kg可抑制C反應(yīng)蛋白(CRP)至少4周，而Tocilizumab 2 mg/kg僅抑制CRP 1周。

圖4. pH依賴性抗IL-6受體抗體在食蟹猴中的藥代動(dòng)力學(xué)

Chaparro-Riggers等人報(bào)道了一種pH依賴性的抗PCSK9抗體的產(chǎn)生。傳統(tǒng)的抗PCSK9抗體在食蟹猴和恒河猴中的半衰期十分短(分別為2.5天和3.2天)。雖然PCSK9是一種可溶性蛋白，但PCSK9結(jié)合會(huì)影響PCSK9抗體的藥代動(dòng)力學(xué)。野生型和PCSK9基因敲除小鼠的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)表明，PCSK9介導(dǎo)了一種常規(guī)PCSK9抗體的TMDD。因此，為了最小化PCSK9介導(dǎo)的TMDD，通過(guò)對(duì)常規(guī)人源化抗PCSK9 IgG2抗體J16進(jìn)行組氨酸掃描，產(chǎn)生了一種pH依賴的抗PCSK9抗體。研究表明常規(guī)抗PCSK9小鼠IgG1抗體J10在野生型小鼠中的半衰期較短(2.9天)，而pH依賴的抗PCSK9小鼠IgG1抗體J17的半衰期達(dá)到14.4天。在FcRn基因敲除小鼠中，pH依賴的PCSK9結(jié)合對(duì)PCSK9介導(dǎo)的TMDD的改善作用減弱，這表明pH依賴性的PCSK9抗體在酸性內(nèi)體中從PCSK9中解離出來(lái)，并以pH依賴的方式與FcRn結(jié)合后，從內(nèi)體循環(huán)到細(xì)胞膜。這些數(shù)據(jù)表明，pH依賴的PCSK9結(jié)合顯著改善了PCSK9介導(dǎo)的TMDD，從而增強(qiáng)了PCSK9抗體的藥代動(dòng)力學(xué)。

以上所述，pH依賴的靶抗原結(jié)合對(duì)TMDD的影響已經(jīng)得到了驗(yàn)證，包括膜結(jié)合的靶抗原和可溶性的靶抗原。當(dāng)在臨床前研究中觀察到TMDD，可以應(yīng)用pH依賴的靶抗原結(jié)合工程來(lái)最小化TMDD。

  小編總結(jié)  

本文介紹了三大可以改善抗體藥代動(dòng)力學(xué)特性的抗體工程技術(shù)。有三個(gè)主要過(guò)程決定了mAb的藥代動(dòng)力學(xué)，可以通過(guò)抗體工程技術(shù)來(lái)調(diào)節(jié)這些過(guò)程。第一個(gè)主要過(guò)程是非特異性內(nèi)吞作用，可通過(guò)PI/電荷工程進(jìn)行調(diào)節(jié)。第二個(gè)過(guò)程是FcRn介導(dǎo)的從內(nèi)體到血漿的循環(huán)，這可以通過(guò)在酸性pH下增加FcRn結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)。第三個(gè)過(guò)程是TMDD，這可以通過(guò)與靶抗原的pH依賴性結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)。目前基于這些抗體工程技術(shù)的治療性抗體已經(jīng)顯示出在動(dòng)物和人類中藥代動(dòng)力學(xué)的改善。相信隨著后續(xù)的研究深入以及臨床進(jìn)展，它會(huì)為患者提供益處，如皮下注射和更長(zhǎng)的給藥間隔以及通過(guò)減少劑量減輕經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

參考文獻(xiàn)

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2.Fc-Engineering for Modulated Effector Functions-Improving Antibodies for Cancer T reatment.

3.Sweeping antibody as a novel therapeutic antibody modality capable of eliminating soluble antigens from circulation.

4.Reduced elimination of IgG antibodies by engineering the variable region.