腹瀉病占全球兒童總死亡率的9%，每年約有44.6萬5歲以下兒童死亡。在撒哈拉以南的非洲和印度次大陸多個(gè)地點(diǎn)進(jìn)行的旨在評(píng)估腹瀉病負(fù)荷及其病因的全面流行病學(xué)研究表明，隱孢子蟲原蟲是幼兒腹瀉病和死亡的主要原因；而人類隱孢子蟲和小隱孢子蟲是人類隱孢子蟲感染的主要原因。急性隱孢子蟲感染估計(jì)每年導(dǎo)致幼兒48,000人死亡，并損失420萬傷殘調(diào)整生命年(DALYs)。隱孢子蟲感染還與兒童生長遲緩有關(guān)。然而，這種疾病并不局限于低收入國家；盡管有先進(jìn)的水處理技術(shù)，隱孢子蟲病在美國和歐洲也很常見。美國半數(shù)以上的水傳播疾病都是由隱孢子蟲引起的，通常與娛樂用水有關(guān)，環(huán)境中的部分隱孢子蟲孢子樣卵囊已經(jīng)對(duì)氯化反應(yīng)具有抗藥性。隱孢子蟲長期以來也被認(rèn)為是一種機(jī)會(huì)性病原體，可導(dǎo)致免疫功能低下的人(如艾滋病毒/艾滋病患者或器官移植受者)受到威脅生命的感染。

    目前治療隱孢子蟲病的選擇很少，而且沒有可用的疫苗。FDA僅批準(zhǔn)了一種治療隱孢子蟲病的藥物硝唑胺。硝唑胺可適度加速免疫能力個(gè)體的康復(fù)。然而，對(duì)于那些最需要它的病人：營養(yǎng)不良的兒童和免疫功能低下的人，它無法起到治療效果。最近對(duì)隱孢子蟲病的全部公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)的認(rèn)識(shí)，提升了對(duì)隱孢子蟲病的關(guān)注，促進(jìn)了抗隱孢子蟲治療方法的研發(fā)。用現(xiàn)有藥物來治療被忽視的熱帶疾病隱孢子蟲病，可能會(huì)降低經(jīng)濟(jì)成本。這種方法可以改變現(xiàn)有藥物的用途，或者利用現(xiàn)有藥物開發(fā)項(xiàng)目的化合物和結(jié)果來加速被忽視疾病的研究和降低成本。

    為了確定新的抗隱孢子蟲藥物先導(dǎo)和潛在靶點(diǎn)，美國伊利諾斯大學(xué)研究人員測試了具有已知作用機(jī)制的抗微生物化合物。一共集合了59個(gè)具有之前報(bào)道的抗菌活性的化合物，使用細(xì)胞為基礎(chǔ)的高內(nèi)涵顯微鏡分析測試作為篩選策略，來評(píng)估它們對(duì)愛荷華小隱孢子蟲株的作用。篩選發(fā)現(xiàn)了多種潛在靶點(diǎn)的抑制劑，包括細(xì)胞色素bc1復(fù)合物、熱休克蛋白90 (HSP90)、組蛋白去乙酰化酶(HDACs)、磷脂酰肌醇4-激酶(PI4K)和多種tRNA合成酶。其中，鑒定的最有效的生長抑制劑是雙環(huán)氮雜環(huán)化合物 BRD3914，它對(duì)愛荷華Bunch Grass Farm小隱孢子蟲株的有效中值濃度(EC50)為62 nM。其原本就是正在開發(fā)用于治療瘧疾的雙環(huán)氮雜環(huán)系列，因此可以利用這些抗瘧研究中獲得的藥物化學(xué)經(jīng)驗(yàn)來開發(fā)抗隱孢子蟲藥物。

    雙環(huán)氮雜環(huán)系列化合物通過抑制PfcPheRS發(fā)揮其抗瘧活性，研究人推測BRD3914的抗隱孢子蟲活性可能是抑制小隱孢子蟲 (C. parvum)的苯丙氨酰- tRNA合成酶 (CpPheRS)的直接結(jié)果。研究人員篩選出9種抗惡性瘧原蟲活性范圍從納摩爾到微摩爾的雙環(huán)氮雜環(huán)類化合物，并對(duì)其抗瘧原蟲活性進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果表明，其對(duì)惡性瘧原蟲與小隱孢子蟲的抑制活性活性呈正相關(guān)(r = 0.883)，表明一種保守的作用機(jī)制對(duì)這兩種寄生蟲都起作用。繼而，研究人員對(duì)雙環(huán)氮雜環(huán)化合物衍生物的抗隱孢子蟲活性進(jìn)行了評(píng)估，并在該系列中發(fā)現(xiàn)了不同的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的分子(dibasic, BRD7929; zwitterion, BRD3316和monobasic, BRD8494)。這些雙環(huán)氮雜環(huán)化合物顯示出廣泛的活性，與被測的C. parvum分離株無關(guān)，并且對(duì)C. hominis和C. parvum具有相當(dāng)?shù)墓πАＬ貏e是在1%胎牛血清(FBS)] 的培養(yǎng)條件下，BRD7929對(duì) C. parvum 的EC50 = 9 nM和C. hominis EC50 = 10 nM。

考慮到隱孢子蟲病治療的主要目標(biāo)人群是2歲以下的兒童，必須滿足良好的安全性要求。研究人員評(píng)估了這6種化學(xué)同系物的細(xì)胞毒性，比較C. parvum愛荷華株(1%胎牛血清)的EC50與人回盲腺癌(HCT-8)細(xì)胞的半最大細(xì)胞毒性濃度(CC50)，觀察到所有化合物的選擇性指數(shù)為>100；特別是，BRD5630的選擇性指數(shù)可以達(dá)到> 10000。

    體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用了隱孢子蟲病感染模型，利用3 ~ 4周大、剛斷奶、嚴(yán)重合并免疫缺陷型(NSG)小鼠，口服小隱孢子蟲卵囊(~1 x 105)。采用小隱孢子蟲特異性引物對(duì)糞便進(jìn)行定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)檢測。三種強(qiáng)效化合物(BRD7929, BRD3316, BRD3444, C.parvum EC50 <73 nM)及陰性和陽性對(duì)照以每24小時(shí)50 mg/kg(體重)口服給藥，共4天。三種雙環(huán)氮雜環(huán)類化合物治療后卵囊脫落率均較低(BRD7929的P < 0.05)。特別是，BRD7929顯示每毫克糞便的卵囊減少了近3-log。然后，使用相同的免疫缺陷小鼠模型對(duì)BRD7929進(jìn)行了劑量范圍研究，給藥方案為每24小時(shí)給藥5, 20, 40 mg/kg，連續(xù)4天，檢測卵囊脫落率；每24小時(shí)給藥10mg/kg，連續(xù)7天，觀察小鼠14天是否感染復(fù)發(fā)。BRD7929的劑量為每24小時(shí)10mg/kg，連續(xù)7天，14天后無復(fù)發(fā)。除了BRD8494外，雙環(huán)氮雜類藥物耐受性良好。在體內(nèi)測試的八種其他雙環(huán)丙嗪類藥物的體重減輕<5%，并且沒有觀察到小鼠行為學(xué)上的不良影響。

    接下來，研究人員檢測了這些雙環(huán)氮雜環(huán)類化合物在體內(nèi)最佳PK/PD關(guān)系。隱孢子蟲感染的原發(fā)部位是腸上皮，這與瘧疾不同，瘧原蟲在肝細(xì)胞和紅細(xì)胞中發(fā)育。雖然良好的腔內(nèi)暴露對(duì)體內(nèi)療效很重要，但對(duì)于治療隱孢子蟲病所需的最佳生物利用度，目前尚無整體共識(shí)。減少全身性暴露可提高隱孢子蟲病藥物的安全性，然而，有一種擔(dān)憂是，僅在胃腸道暴露可能導(dǎo)致與疾病相關(guān)的水樣腹瀉的藥物沖刷，并且可能不是治療膽道上皮感染的最佳方法。于是，研究人員確定了8種化合物(包括BRD7929、BRD3316和BRD3444)的生物利用度為從1到86%，具有較高生物利用度的類似物(BRD7929、BRD8494和BRD6630)每毫克糞便中卵囊減少量最大。

    研究人員基于隱孢子蟲的生命周期，使用一系列表型分析進(jìn)一步在體外研究了BRD7929的抗隱孢子蟲作用機(jī)制。EdU熒光顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn)，BRD7929對(duì)寄生蟲侵襲宿主細(xì)胞的過程沒有影響，但強(qiáng)烈抑制細(xì)胞內(nèi)寄生蟲的發(fā)育。通過監(jiān)測BRD7929在培養(yǎng)的前48小時(shí)對(duì)無性繁殖的影響，以及性發(fā)育生物標(biāo)志物減數(shù)分裂重組蛋白DNA減數(shù)分裂重組酶1 (DMC1)的表達(dá)情況，比較了BRD7929對(duì)小孢子蟲性發(fā)育的抑制作用和對(duì)無性繁殖的抑制作用，48到72小時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間與其他隱孢子蟲aaRS抑制劑觀察到的一樣，BRD7929在兩種檢測中幾乎是等效的，即生長和發(fā)育階段有相同的抑制效果。要想成功治療艾滋病患者、移植受者和營養(yǎng)不良兒童等免疫缺陷患者，可能需要藥物能在缺乏免疫系統(tǒng)大量幫助的情況下迅速消滅寄生蟲。感染了C. parvum的NSG小鼠在使用慢效抗隱孢子蟲的盤龍霉素和氯法齊明治療后迅速復(fù)發(fā)或沒有任何改善，但這兩種化合物對(duì)免疫缺陷較輕的小鼠都有效。與在NSG小鼠模型中觀察到的效果一致的是，BRD7929能快速從體外培養(yǎng)中去除C. parvum，在濃度為3×EC90時(shí)首次達(dá)到最大清除率。在體外，BRD7929對(duì)寄生蟲的消除呈指數(shù)增長，消除99.9%的寄生蟲的半數(shù)時(shí)間為~9.5和~95小時(shí)。

    此前對(duì)惡性瘧原蟲進(jìn)行的體外抗性選擇實(shí)驗(yàn)和全基因組測序發(fā)現(xiàn)了PheRS中的點(diǎn)突變，這些突變賦予了對(duì)雙環(huán)氮雜環(huán)化合物BRD1095的抗性，尤其是評(píng)估小隱孢子蟲中內(nèi)源的482位亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸，是否會(huì)獲得對(duì)BRD7929的抗性。研究人員用這種混合的轉(zhuǎn)基因寄生蟲(L482 + V482)或?qū)φ?WT L482)，用BRD7929 (10 mg/kg)處理5天(感染后第4至8天)。通過測量糞便中的發(fā)光來跟蹤寄生蟲的脫落情況，發(fā)現(xiàn)在藥物處理3天后(感染第7天)，兩株菌株的熒光素酶活性均有所下降，但混合種群的寄生蟲明顯反彈。在治療后的第8天和第11天通過PCR擴(kuò)增pheRS基因，每天測序8個(gè)獨(dú)立克隆。與輸入群體相比，恢復(fù)的序列均在核苷酸1444位發(fā)生突變，丟失了野生型等位基因，說明該482位突變在BRD7929處理下具有選擇優(yōu)勢。

    為了進(jìn)一步確定CpPheRS作為本系列的分子靶標(biāo)，研究人員純化了重組ChPheRS蛋白，并測定了其在雙環(huán)氮雜環(huán)化合物作用下的氨基?；傅幕钚?。在氨基?；磻?yīng)的第一步，PheRS使用ATP和L-苯丙氨酸形成氨基?；佘账釓?fù)合物，釋放焦磷酸(PPi)。在第二步，氨基?；D(zhuǎn)移到同源tRNA釋放AMP。在這里，我們用孔雀石綠吸光度法測定了PPi轉(zhuǎn)化為無機(jī)磷酸鹽(Pi)后的產(chǎn)量。BRD7929對(duì)重組ChPheRS的抑制作用呈濃度依賴性(IC50 = 60 nM)。在此生化試驗(yàn)中觀察到的效力與人隱孢子蟲試驗(yàn)中觀察到的效力相似BRD7929 ChPheRS(1%胎牛血清)EC50 = 10nM，提示抑制ChPheRS完全解釋了觀察到的細(xì)胞效能。ChPheRS對(duì)BRD7929的生化效力也與之前報(bào)道的PfcPheRS相似(IC50 = 23 nM)，進(jìn)一步表明了一種保守的作用機(jī)制。

本文的研究人員使用老藥新用的化合物重定位的方法，節(jié)省了新藥開發(fā)的經(jīng)濟(jì)成本，縮短了開發(fā)時(shí)間，并且結(jié)合表型篩選和結(jié)構(gòu)篩選的優(yōu)點(diǎn)，為被忽視疾病的藥物開發(fā)提供了良好的新思路。

參考文獻(xiàn)：

[1] Vinayak S, Jumani R S, Miller P, et al. Bicyclicazetidines kill the diarrheal pathogen Cryptosporidium in mice by inhibitingparasite phenylalanyl-tRNA synthetase[J]. Science Translational Medicine, 2020,12(563).