北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）、生命科學(xué)學(xué)院研究員

名校學(xué)子， 回報母校

據(jù)了解，白凡早前畢業(yè)于北京大學(xué)物理系，在遠(yuǎn)赴英國牛津大學(xué)攻讀并取得博士學(xué)位后，他曾先后在牛津大學(xué)和大阪大學(xué)（日本）進(jìn)行過博士后研究。2011年，滿載著國外留學(xué)和科研工作中積累的豐富學(xué)識和經(jīng)驗，白凡選擇回到母校任職，并先后承擔(dān)多項自然科學(xué)基金委、科技部和北京市科委的科研項目。在北大工作期間，白凡研究員和團(tuán)隊一直致力于通過對癌癥病人外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell, CTC）進(jìn)行單細(xì)胞分析，深入探索癌癥轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制以及實現(xiàn)無創(chuàng)癌癥診斷、預(yù)后判斷、療效評價的臨床方法。

近年來，他們已經(jīng)利用單細(xì)胞測序技術(shù)在CTC、腫瘤異質(zhì)性及克隆起源等課題上取得了重大突破和進(jìn)展。他們在世界范圍內(nèi)第一個報道了單個CTC的全基因組測序結(jié)果并獲得廣泛關(guān)注 （PNAS，2013）；他們通過單細(xì)胞基因測序分析了結(jié)直腸癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌以及肝癌等不同癌種中CTCs的特征與差異，進(jìn)一步揭示了腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制和克隆起源等問題，具有重要的科學(xué)意義和臨床價值（Genome Research，2017）。近期，白凡研究團(tuán)隊又把研究重點轉(zhuǎn)到了小細(xì)胞肺癌上，通過CTCs實現(xiàn)對小細(xì)胞肺癌腫瘤突變特征的無創(chuàng)探測和病人化療敏感性的預(yù)測（Clinical Cancer Research, 2019）。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞在癌癥轉(zhuǎn)移中的中介作用 

如今，CTCs的定義已經(jīng)比較明確——它們是以不同形態(tài)存在于外周血中的各類腫瘤細(xì)胞的統(tǒng)稱，既有游離的單個CTC，也有聚集成團(tuán)的細(xì)胞團(tuán)（CTM，Circulating Tumor Microemboli）。它們源于自發(fā)或臨床診療操作中從實體腫瘤病灶（腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶）的脫落，能夠越過組織間基底膜并入侵組織基質(zhì)，從而進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)。

“現(xiàn)在，我們對癌癥轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟已經(jīng)有了比較清晰的認(rèn)識，而CTC在癌癥轉(zhuǎn)移中起了關(guān)鍵的中介作用，”白凡研究員介紹道，“當(dāng)這些CTCs進(jìn)入到血液循環(huán)系統(tǒng)后，它們就會沿著血液快速地擴(kuò)張到其他身體部位。雖然這一過程中大部分CTCs會發(fā)生凋亡或被吞噬，但少數(shù)能夠逃逸并存活。一旦這些逃逸的CTCs在一些其他組織的毛細(xì)血管里停留下來，就會啟動另一過程離開毛細(xì)血管去重新建立和發(fā)展成為新的轉(zhuǎn)移灶。這大大增加了惡性腫瘤患者的死亡風(fēng)險。” 

事實上，早在一個多世紀(jì)前（1869年），澳大利亞籍醫(yī)生Thomas Ashworth 就在癌癥病人中首次觀測到了CTC。他發(fā)現(xiàn)病人外周血中一些異常形態(tài)的細(xì)胞與癌細(xì)胞非常相似，于是提出了這樣的猜測：那些異常形態(tài)的細(xì)胞是否與癌癥的廣泛多器官轉(zhuǎn)移有著直接的關(guān)系呢？遺憾的是，當(dāng)時Thomas Ashworth無法提取CTCs來繼續(xù)追蹤它們的“來龍去脈”。

研究者多年來都希望能夠從病人外周血中捕獲CTCs來進(jìn)行更有效的研究，但這一細(xì)胞群體的數(shù)量十分稀少，而且混雜在大量的血細(xì)胞之中。條件和技術(shù)的限制使得CTCs的研究一直受阻。白凡研究員解釋說：“正常人1m?l血液里大概有1億血紅細(xì)胞，100萬左右白細(xì)胞。然而在一毫升癌癥病人血液里，往往只能分離到幾個到幾十個CTC?s。因此，捕獲和分離CTCs去進(jìn)一步研究是一個十分有挑戰(zhàn)的難題。”一些研究也表明：1 g腫瘤組織，大約有100萬個腫瘤細(xì)胞，可每日播散腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液。然而CTCs的數(shù)量在循環(huán)血液中常呈現(xiàn)出動態(tài)遞減的特點，到達(dá)外周血時已十分稀少。

單細(xì)胞測序技術(shù)鑒定和表征循環(huán)腫瘤細(xì)胞

直到近些年，對細(xì)胞富集、分離和鑒定分析等新技術(shù)的快速發(fā)展以及測序技術(shù)的飛躍重新點燃了CTCs這一領(lǐng)域的研究，讓CTCs作為一種臨床中切實可行的腫瘤評估方法逐漸變成可能。白凡研究團(tuán)隊最早關(guān)于CTCs的研究是從分析肺癌病人CTCs的基因組拷貝數(shù)變化 （copy number variation-CNV）模式和點突變開始的。現(xiàn)在已經(jīng)有很多的不同的方法來分離CTCs，他們主要通過目前唯一經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)用于檢測CTCs的Cell search平臺來獲取和分離單個CTC，并對其遺傳物質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增和全基因組測序。這一突破性結(jié)果發(fā)表在2013年《PNAS》上，并在同年《Nature Methods》特別報道中（singled out for sequencing ）得到重點引用。

在分析了CTC單細(xì)胞全基因組的CNV模式并將該數(shù)據(jù)與相關(guān)實體腫瘤平行數(shù)據(jù)進(jìn)行比較后，白凡研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)CTCs與原發(fā)位和轉(zhuǎn)移位腫瘤中存在明確的基因共同區(qū)域的缺失與擴(kuò)增，而且來自同一病人CTCs 的CNV 模式具有一致性。同時，同一亞型的肺癌患者中，CNV模式在肺癌發(fā)生發(fā)展的重要區(qū)域存在明顯的相似性（如：第8號染色體的后半段有明顯擴(kuò)增）；而在不同亞型的肺癌患者中 （如肺腺癌和小細(xì)胞肺癌），CNV呈現(xiàn)出了不同的模式。白凡研究員總結(jié)道：“這提示可以對外周血CTCs進(jìn)行全基因組CNV檢測，根據(jù)CNV推測肺癌的不同亞型。”

2013 《Nature Methods》上 singled out for sequencing 特別報道

不僅如此，白凡研究團(tuán)隊還通過CTCs基因測序在肺腺癌向小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)化的患者中發(fā)現(xiàn)，癌癥治療中產(chǎn)生的耐藥性與特定抑癌基因的點突變具有明確相關(guān)性。結(jié)合病理判斷，他們進(jìn)一步驗證了在產(chǎn)生耐藥性后癌癥能夠以CTCs為途徑從肺部原發(fā)灶向肝部形成新的轉(zhuǎn)移灶。“這些結(jié)果說明，對CTCs的分析可以幫助獲取病人的靶向用藥、耐藥、表型轉(zhuǎn)換等臨床非常關(guān)聯(lián)的重要信息。”白凡研究員這樣評價。另外，他們還通過外周血CTCs基因測序觀測了癌癥治療中不同時間點 （如化療前、一線化療和二線化療）所發(fā)生的點突變，來探知腫瘤克隆的演化過程。

在已有的肺癌研究基礎(chǔ)上，白凡研究團(tuán)隊又將分析經(jīng)驗應(yīng)用到其它中國人高發(fā)的癌癥中，如：對胃癌和乳腺癌進(jìn)行分型、預(yù)測前列腺癌激素治療效果，鑒定結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵標(biāo)志物等。他們將多個癌種的研究結(jié)果匯總，進(jìn)行了跨癌種綜合分析，特別關(guān)注了與癌癥轉(zhuǎn)移驅(qū)動時間相關(guān)的CNV變化，相關(guān)結(jié)果在2017年發(fā)表在《Genome Research》 上。

從單細(xì)胞層面理解腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性和克隆起源

伴隨生命科學(xué)認(rèn)識的深入，研究者們越來越多地發(fā)現(xiàn)同一組織的細(xì)胞之間或同一類型的細(xì)胞之間事實上存在著不同程度的差異，這些差異被稱為細(xì)胞間的“異質(zhì)性”。在許多生命活動的關(guān)鍵問題上，單個細(xì)胞所發(fā)揮的作用其實是非常重要的，如在胚胎發(fā)育，腫瘤，不可培養(yǎng)微生物等的研究上。

腫瘤中的單個細(xì)胞間可以存在很大程度的差異，高度異質(zhì)性的細(xì)胞對癌組織的表型有高度的塑造作用。白凡研究員認(rèn)為，腫瘤的異質(zhì)性是腫瘤在發(fā)生發(fā)展的長期演化過程中，不同的腫瘤克隆之間存在相互競爭的情況下產(chǎn)生的。這種細(xì)胞間的異質(zhì)性對現(xiàn)在的腫瘤治療帶來了很大的挑戰(zhàn)。

傳統(tǒng)研究依賴于群體細(xì)胞測量，通常把同一組織或同一類型的大量細(xì)胞作為研究對象，會掩蓋單個細(xì)胞之間的差異，因此具有局限性。白凡研究員表示，現(xiàn)在有了單細(xì)胞測序技術(shù)，就可以以單個細(xì)胞的精度去研究。如果再結(jié)合生物信息學(xué)的方法，就能夠準(zhǔn)確地把整個腫瘤的異質(zhì)性和它的演化歷史以最高的精度去重現(xiàn)。白凡研究團(tuán)隊利用單細(xì)胞基因測序的結(jié)果構(gòu)建了進(jìn)化樹，并分析了肝癌不同亞型以及混合型肝癌的異質(zhì)性。此外，他們還發(fā)現(xiàn)了混合型肝癌中不同克隆間獨立和共同起源并存的情況并推測了其可能的轉(zhuǎn)移路徑。相關(guān)結(jié)果于2019年發(fā)表在《Cancer Cell》上。

世界肝癌分布（A）、肝癌發(fā)病位置(B)和肝癌異質(zhì)性(C) （Xue et al., 2017）

近期有一些研究表明，癌癥耐藥性與不同藥物作用下細(xì)胞的異質(zhì)性反應(yīng)有關(guān)。對此，白凡研究員也給出了自己的看法：“癌癥的耐藥性確實是一個非常復(fù)雜的問題。除了研究腫瘤細(xì)胞本身，對于免疫細(xì)胞和其它對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有很大促進(jìn)作用的因素也要深入研究和理解。因此，可從兩個方面去考慮：第一個是遺傳層面。也就是說腫瘤細(xì)胞發(fā)生了基因型的變化，產(chǎn)生新的基因型來適應(yīng)藥物的處理以存活下去；另一方面就是非遺傳層面，像是復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境所帶來的影響會增強(qiáng)腫瘤的耐藥性，又或者是腫瘤的表型上的一些改變，比如有些腫瘤細(xì)胞能夠?qū)⒁恍┗熕幬镉行У嘏懦鰜恚梢苑Q之為‘外排泵 ’作用，不讓它對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷。這同樣會增強(qiáng)它的耐藥性。”

對未來癌癥治療藥物的研發(fā)，白凡研究員也談?wù)摿艘恍┱雇＞唧w來說，傳統(tǒng)的大量樣本研究只針對一些重要的基因突變，伴隨著技術(shù)的進(jìn)步，未來的癌癥治療還是有很多的潛力?，F(xiàn)在有了單細(xì)胞精度的癌癥研究，研究人員就可以對腫瘤細(xì)胞里面一些特殊的群體，比如像腫瘤干細(xì)胞或是同時具有多種表型的腫瘤細(xì)胞，又或是對腫瘤微環(huán)境中幫助腫瘤生長的細(xì)胞類群及其它因素，進(jìn)行更深入的研究和理解。這些新知識的獲取會帶來一些新的藥物設(shè)計的思路，展開一些新的癌癥研究領(lǐng)域。