產(chǎn)品概述
Cell Counting Kit-8，簡(jiǎn)稱 CCK-8 試劑盒，是一種基于 WST-8 而廣泛應(yīng)用于
細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速、高靈敏度、無放射性的比色檢測(cè)試劑盒。
CCK-8 溶液可以直接加入到細(xì)胞樣品中，不需要預(yù)配各種成分。WST-8 在
電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色
的formazan  。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，
則顏色越淺。對(duì)于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺 (生成的 formazan 量) 和細(xì)胞數(shù)
目呈線性關(guān)系


細(xì)胞活性檢測(cè)
1. 在96 孔板中接種細(xì)胞懸液 (100 ml /孔 ) 。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng) (在37 ℃，5% CO2的條件下 )。
2. 向每孔加入10 ml 的CCK- 8溶液 (注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響 O.D值的讀數(shù)) 。
3. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1-4小時(shí)。
4. 用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。
5. 如果暫時(shí)不測(cè)定O.D值，打算以后測(cè)定的話，可以向每孔中加入 10 ml 0.1 M HCl溶液或者1% w/vSDS 溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。
在 24小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。  

細(xì)胞增殖 -毒性檢測(cè)
1. 在96 孔板中配制 100 ml的細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng) 24小時(shí) ( 在37℃， 5% CO2的條件下 )。
2. 向培養(yǎng)板加入10 ml不同濃度的待測(cè)物質(zhì)。
3. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間 (例如: 6,12, 24 或48小時(shí) )。    
4. 向每孔加入10 ml CCK-8 溶液 (注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響 O.D值的讀數(shù)) 。
5. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1-4小時(shí)。
6. 用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。
7. 如果暫時(shí)不測(cè)定O.D值，打算以后測(cè)定的話，可以向每孔中加入 10 ml 0.1 M HCl溶液或者1% w/vSDS 溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。
在 24小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。
注意：如果待測(cè)物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加 CCK-8之前更換新鮮培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。
當(dāng)然藥物影響比較小的情況可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。  

制作標(biāo)準(zhǔn)曲線
1. 先用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，然后接種細(xì)胞。
2. 按比例 ( 例如：1/2比例 ) 依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度，一般要做 3-5個(gè)細(xì)胞濃度梯度，每組3-6個(gè)復(fù)孔。
3. 接種后培養(yǎng)2-4 小時(shí)使細(xì)胞貼壁，然后加 CCK-8試劑培養(yǎng)一定時(shí)間后測(cè)定 O.D值，制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo) (X軸) ，O.D值為縱坐標(biāo) (Y軸) 的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測(cè)定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量 (使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提條件是實(shí)驗(yàn)的條件要一致，便于確定細(xì)胞的接種數(shù)量以及加入 CCK-8后的培養(yǎng)時(shí)間)。



計(jì)算公式
細(xì)胞存活率=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%
抑制率=[(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100%
As: 實(shí)驗(yàn)孔吸光度 (含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8 溶液和藥物溶液) ；
Ac: 對(duì)照孔吸光度 (含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8 溶液，不含藥物) ；
Ab: 空白孔吸光度 (含培養(yǎng)基、CCK-8 溶液，不含細(xì)胞、藥物) 。

Cell line : HEK293
Medium : DMEM, 10% FBS
Incubation : 37°C, 5% CO2, 2 hours

Cell line : U87, SK-HEP1
Medium : DMEM, 10% FBS
Chemicals : 200 μM Cisplatin (DDP)
Incubation : 37°C, 5% CO2, 2 hours

注：如果待測(cè)藥物有氧化性或還原性，可在加入 CCK-8 之前更換新鮮培養(yǎng)
基，去掉待測(cè)藥物的影響。當(dāng)待測(cè)藥物影響比較小的情況下可以不更換培
養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入待測(cè)藥物后的空白吸收即可。
WST-8 是 MTT 的一種升級(jí)替代產(chǎn)品，和 MTT 或其它 MTT 類似產(chǎn)品，如
XTT、MTS 等相比有明顯的優(yōu)點(diǎn)。
第一，MTT被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原
生成的 formazan 不是水溶性的，需要有特定的溶劑來溶解；而 WST-8 和
XTT 、MTS 產(chǎn)生的 formazan 都是水溶性的，可以省去后續(xù)的溶解步驟。
第二，WST-8 產(chǎn)生的 formazan 比 XTT 和 MTS 產(chǎn)生的 formazan 更易溶解。
第三，WST-8 比 XTT 和 MTS 更加穩(wěn)定，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更可靠。
第四，WST-8和 MTT、XTT 等相比線性范圍更寬，靈敏度更高，并且更加穩(wěn)定。
WST-8 對(duì)細(xì)胞無明顯毒性。加入 CCK-8 溶液顯色后，可以在不同時(shí)間反復(fù)
用酶標(biāo)儀讀板，檢測(cè)時(shí)間更加靈活，便于確定最佳測(cè)定時(shí)間。

注意事項(xiàng)
1. CCK-8 的培養(yǎng)時(shí)間一般為 1-4 小時(shí)，但在培養(yǎng) 30 分鐘左右即可取出肉眼
觀察顯色程度，根據(jù)細(xì)胞種類而定，需要摸索條件，CCK-8 的最佳反應(yīng)時(shí)
間以具體顯色的最佳時(shí)間為準(zhǔn)。
2. 使用 96 孔板進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，一定要注意蒸發(fā)問
題。一方面，由于 96 孔板周圍一圈最容易蒸發(fā)，可以采取棄用周圍一圈
的辦法，改加相同量的 PBS 、水或培養(yǎng)液；另一方面，可以把 96 孔板置
于靠近培養(yǎng)箱內(nèi)水源的地方，以緩解蒸發(fā)。
3. 本試劑盒的檢測(cè)依賴于脫氫酶催化的反應(yīng)，所以還原劑 (例如一些抗氧
化劑) 會(huì)干擾檢測(cè)，如果待檢測(cè)體系中存在較多的還原劑，需設(shè)法去除。
用酶標(biāo)儀檢測(cè)前需確保每個(gè)孔內(nèi)沒有氣泡，否則會(huì)干擾測(cè)定。
4. 加入藥物中如含有金屬，對(duì) CCK-8 顯色有影響。終濃度為 1 mM 的氯化
亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會(huì)抑制 5% 、15% 、90% 的顯色反應(yīng)，使靈敏度降
低。如果終濃度是 10 mM 的話，將會(huì) 100% 抑制。
5. 培養(yǎng)基中的酚紅不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，酚紅的吸光度可以在計(jì)算時(shí)，通過
扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會(huì)對(duì)檢測(cè)造成影響。
6. 本產(chǎn)品可以檢測(cè) ，但不能檢測(cè)酵母細(xì)胞。向 100 μL 培養(yǎng)液
中加入 10 μL CCK-8 溶液，并培養(yǎng) 1-4 小時(shí)或過夜。
7. CCK-8 試劑對(duì)細(xì)胞的毒性非常低。它和活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶持續(xù)反應(yīng)使溶
液顏色不斷加深，OD 值不斷增加 (注: 活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶是持續(xù)產(chǎn)生的) 。
8. 要測(cè)定細(xì)胞的具體數(shù)量，建議同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
9. 建議采用多通道移液器，以減小平行孔間的差異。
10. 以下方法可以終止 CCK-8 反應(yīng) (96 孔板) ：
(a). 在顯色反應(yīng)后，將培養(yǎng)板放置 4°C 冰箱內(nèi)。(b). 每孔加 10 μL 0.1 M HCl
溶液。(c). 每孔加 10 μL 1% (w/v) 的 SDS (十二烷基硫酸鈉) 溶液。
注意：反應(yīng)停止后，應(yīng)在 24 小時(shí)內(nèi)測(cè)定。
11. 本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不
得用于食品或藥品。
12. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。